尊龙凯时中的Western Blot技术原理与Southern或Northern杂交方法相似，但使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质检测。这里的“探针”是抗体，而“显色”则采用标记的二抗。经过PAGE电泳分离的蛋白质样品会被转移到固相载体（如硝酸纤维素膜）上，该载体以非共价结合的方式吸附蛋白质，从而保持电泳分离的多肽类型及生物活性不变。随后，固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原与相应的抗体进行免疫反应，再通过酶或同位素标记的二抗进行反应，最终通过底物显色或放射自显影来检测特定蛋白质的表达。这项技术广泛应用于蛋白表达水平的检测，是初步鉴定蛋白质过程中最方便且通用的方法。其中，Western Blot的显色方式主要包括：放射自显影、底物化学发光（ECL）、底物荧光（ECF）和底物DAB呈色。常见的是底物化学发光，尤其是ECL方法，因为其操作简单，且可通过购买现成的试剂盒来实现。其基本原理如下：二抗使用HRP标记，反应底物为过氧化物与鲁米诺，当HRP存在时会发光，从而使胶片曝光，显示出条带。

尊龙凯时的Western Blot技术包括以下几个步骤：

操作步骤

一、配胶

1. 确保玻璃板清洗干净，最终用去离子水冲洗，将接触胶的面向下倾斜置于干净纸巾上晾干。可以提前配好分离胶和浓缩胶（除AP和TEMED外），过滤后避光储存于4℃，可存放至少1个月。临时使用时，需在室温平衡。加入10%AP及TEMED后，调节浓度。低温时可适当提高AP及TEMED浓度。

2. 封胶时，封胶应在灌入2/3分离胶后立即进行，低于10%浓度时可使用0.1%的SDS封胶，高于10%则使用水饱和的异/丁醇。胶凝后，封胶液需冲洗干净。

3. 灌好浓缩胶后，等待1小时拔除梳子，拔除时边加水边移除，以避免产生气泡。用去离子水冲洗胶孔，后续可加0.1%的SDS封胶。

二、样品处理

细胞样品的定性和定量处理方式略有不同。定性处理包括用PBS冲洗并添加加热的loading buffer，再进行热处理和超声处理。定量处理则在培养后使用预冷的裂解液，确保在低温下快速处理。

三、电泳

上样前需去掉胶板下的气泡，所有样品需调至等浓度后上样，记得使用1×loading buffer调节Marker的浓度。之后进行电泳，初始电压为45V，并在电压到达65V时转为恒压电泳，结束时目标蛋白应游动至距离胶下缘1cm以上。

四、转膜

使用合适的转移液准备膜，湿转时要注意膜的浸泡与保护，干转注意电流参数控制。电转过程中需保持低温。

五、封闭及杂交

膜在封闭液中轻摇浸泡以减少背景，结合一抗后要经过充分洗涤，再结合二抗并进行化学发光反应，以便后续分析。记得使用含有脱脂奶粉的PBST或TTBS作为封闭液。

六、发光鉴定

采用辣根过氧化物酶（HRP）与化学发光法（ECL）或碱性磷酸酶（AP）显色方法，进行发光检测。操作时需尽量减少光照干扰，以确保条带可视化。

七、注意事项

在使用尊龙凯时的Western Blot技术时，灵活运用洗涤和反应时间可显著提高敏感性。此外，NC膜的多次使用可以通过简单的洗涤步骤进行再利用。

总结而言，Western Blot是一种强大且实用的蛋白质检测技术，结合尊龙凯时的质量保证，能够为生物医学研究提供准确而可靠的实验数据。