IPS诱导肠类器官的培养分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将重点讨论第二阶段，即内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

在进行内胚层分化及中/后肠模式化诱导前，准备以下试剂与设备：

• 细胞： H1/H9hESC或患者来源的iPSCs。
• 培养基： 人多能干细胞培养基(abs9403)、RPMI1640(abs9484)。
• 消化液： 人多能干细胞消化液(abs9409)。
• 培养基添加剂： L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、双抗(abs9244)。
• 生长因子： ActivinA(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。
• 基质胶： 即用型基质胶（培养板包被）(abs9410)、类器官专用基质胶(abs9495)。
• 血清： 透析胎牛血清(abs945)。
• 关键设备： 表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

内胚层分化培养基的配制步骤如下：

• Day 1： RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM) + 双抗(1%) + ActivinA(100ng/mL)。
• Day 2： Day 1配方 + 透析胎牛血清(0.2%)。
• Day 3： Day 1配方 + 透析胎牛血清(2%)。

中/后肠分化培养基的配制则为：RPMI1640 + 透析胎牛血清(2%) + FGF4(500ng/mL) + WNT3a(500ng/mL)。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时约2小时）

使用人多能干细胞消化液对hPSCs进行消化，直至边缘卷起。采用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，并反复吹打至1-2mm大小的细胞团。按1:6的比例接种至Matrigel包被的24孔板中，每孔约5000个细胞团，轻敲培养板使细胞均匀分布后，在37°C下过夜培养。

2. 细胞扩增至85-90%融合（约3-4天）

每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。特别注意：密度过高可能导致自发分化，而密度过低则会影响分化效率，如有必要需重新铺板。

三、内胚层分化（为期3天）

1. Day 1： 吸除人多能干细胞培养基，加入Day 1内胚层培养基（无血清），培养24小时。
2. Day 2： 更换为Day 2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），培养24小时。
3. Day 3： 更换为Day 3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24小时。
4. 验证分化效率（可选）： 通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，效率应达到85-90%。

四、中/后肠模式化（为期3-4天）

1. 诱导球状体形成： 吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，每日更换。48小时后，通过立体显微镜观察上皮增厚，至72-96小时，球状体(spheroids)脱离单层细胞。
2. 收集球状体： 使用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，置于冰上备用。

本期推荐的产品包括人多能干细胞培养基、消化液、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液等，通过尊龙凯时的产品，能够获得高质量的实验结果。

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