第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量：测定不同样品中基因表达量的相对值

在进行相对定量时，选择合适的内参基因至关重要。以下是选择内参基因时应遵循的原则：

• (1) 始终选择表达丰厚且均一的基因作为内参基因；
• (2) 不要盲目选择常用的内参基因；
• (3) 常用内参基因包括：GAPDH、Actin、Tublin。

内参基因的选择直接影响到实验结果的有效性。加入内参基因后，进行结果计算。

二、绝对定量：根据标准品测定样品中基因表达量的绝对值

绝对定量是通过标准品来测定样品中基因的表达量（拷贝数）。标准品包括：

• A. 具有明确拷贝数浓度的样品；
• B. 克隆质粒；
• C. PCR产物；
• D. cDNA（扩增效率测定等用途可以使用，绝对定量不能使用）。

拷贝数的计算需要考虑平均分子量（MW）：

• dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)；
• ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)；
• ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)。

拷贝数计算公式为：

(6.02 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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