第三章:实时荧光定量PCR的应用
一、相对定量:测定不同样品中基因表达量的相对值
在进行相对定量时,选择合适的内参基因至关重要。以下是选择内参基因时应遵循的原则:
- (1) 始终选择表达丰厚且均一的基因作为内参基因;
- (2) 不要盲目选择常用的内参基因;
- (3) 常用内参基因包括:GAPDH、Actin、Tublin。
内参基因的选择直接影响到实验结果的有效性。加入内参基因后,进行结果计算。
二、绝对定量:根据标准品测定样品中基因表达量的绝对值
绝对定量是通过标准品来测定样品中基因的表达量(拷贝数)。标准品包括:
- A. 具有明确拷贝数浓度的样品;
- B. 克隆质粒;
- C. PCR产物;
- D. cDNA(扩增效率测定等用途可以使用,绝对定量不能使用)。
拷贝数的计算需要考虑平均分子量(MW):
- dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基);
- ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基);
- ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)。
拷贝数计算公式为:
(6.02 x 1023 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml
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