神经元间的突触信号传递在神经信息处理过程中具有重要作用，而精确的突触标记工具对于研究神经环路的连接性和可塑性至关重要。传统的免疫组化方法因为需要固定组织而无法在活体中观察，并且难以区分特定突触斑点的来源细胞。近年来，遗传编码的荧光蛋白为活体或固定组织的细胞类型特异性标记提供了新途径，但在标记突触时仍面临局限。例如，基于GFP表达的兴奋性树突棘标记方法无法识别树突干上的抑制性突触，也无法标记不形成特定突触小泡结构的无棘神经元上的兴奋性突触。外源性突触蛋白融合荧光团的表达方法可能干扰突触的生理功能。因此，研究人员开发了不改变内源性蛋白水平的基因编码工具。

其中，由mRNA展示技术生成的纤维连接蛋白内抗体（FingR）能够特异性结合突触蛋白PSD95（兴奋性突触的支架蛋白）和gephyrin（抑制性突触的支架蛋白），实现对兴奋性和抑制性突触的荧光标记，并不干扰突触的生理功能。这些工具通过转染或胚胎期电穿孔引入，已成功应用于神经元培养、小鼠脑切片和活转基因斑马鱼中。然而，之前缺乏适用于脑部的便捷病毒载体。

美国波士顿大学的HanLab在Iscience期刊上发布了一项名为“AViralToolboxofGeneticallyEncodedFluorescentSynapticTags”的研究，开发了携带PSD95FingR和GephyrinFingR的腺相关病毒（AAV）载体。这些病毒载体具有强大的组成型和Cre诱导型表达能力，可以用于标记皮层及皮层下脑区中的兴奋性或抑制性突触。研究人员筛选出具有突触靶向特异性的N端融合红色FingR，成功包装入AAV载体中，从而实现双色突触标记，支持全脑或细胞类型特异性的标记。

为了推广基于FingR的突触标记策略，研究者构建了两种AAV基因组载体：AAV-EF1a-PSD95FingR-GFP-CCR5TC和AAV-EF1a-GephyrinFingR-GFP-CCR5TC。这两种载体在强启动子EF1a的驱动下表达PSD95FingR和GephyrinFingR，并在GFP的C端融合了CCR5转录反馈调节域，用于调控FingR的表达水平。为确保在啮齿动物中获得理想的表达效果，研究人员选择了AAV9衣壳蛋白来包装这些病毒颗粒。

在小鼠大脑的皮层、纹状体和海马区注射这两种病毒载体后，经过3周的组织化学处理，结果显示所有测试脑区及标记的细胞核中均检测到强烈的GFP点状模式表达。PSD95FingR的斑点密度在所有测试脑区中均高于GephyrinFingR，这与先前发现兴奋性突触密度高于抑制性突触的结果一致。通过传统抗体染色分析免疫荧光与GFP的共定位，验证了标记斑点的身份，结果显示GephyrinFingR-GFP与gephyrin抗体在小鼠脑切片中的共定位率达到69.1%±6.0%；而PSD95FingR-GFP与兴奋性突触后标记物Homer及突触前标记物Bassoon也显示出强烈的共定位。

为实现同一神经元中兴奋性和抑制性突触的双色标记，研究人员设计了一种红色荧光蛋白FingR变体，与绿色FingR配合使用。经过实验发现，N端融合的mScarlet-GephyrinFingR比C端融合的展示出更明显的斑点状表达模式，表明荧光蛋白的位置影响FingR的表达水平。由此研究者筛选了其他红色荧光蛋白并将其融合到GephyrinFingR的N端，以提供可靠的双色突触标记工具。

为了研究新生神经元的突触发育，研究人员利用搭载突触蛋白启动子的逆转录病毒表达系统，分别表达PSD95FingR和GephyrinFingR，以标记兴奋性和抑制性突触。该系统能够在病毒注射后1天内，特异性标记成年新生颗粒细胞，并通过负反馈转录控制确保标记蛋白水平与内源性蛋白一致。注射后4周进行分析，结果显示PSD95FingR标记的兴奋性突触主要集中在树突棘，而GephyrinFingR标记的抑制性突触则主要位于树突干。

此外，研究还开发了一种基于Cre诱导的FingRAAV载体，研究多巴胺耗竭对无棘神经元突触的影响，发现即使在多巴胺耗竭后，胆碱能神经元的抑制性突触密度也未发生显著变化。这表明Cre诱导的AAV-FingR病毒载体在分析疾病模型中的突触重组中显示了广泛的应用潜力，为研究帕金森病等神经退行性疾病的病理机制提供了新工具。

本研究开发的基于遗传编码荧光突触标签的病毒工具箱，能够广泛应用于小鼠大脑中兴奋性和抑制性突触的FingR标记，实现全脑或细胞特异性的标记。通过该工具，研究人员可以深入理解神经可塑性和疾病关联，为神经科学研究提供强大支持。尊龙凯时将提供系列突触标记AAV工具，期待为您的科研项目提供有力支持！