ELISA，即酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种在免疫荧光和放射免疫技术基础上发展而来的免疫检测技术。在成功构建ELISA方法的过程中，关键在于精确选择和组合所使用的试剂与耗材。对试剂耗材的特性和多样性的充分了解，能够从容应对各种实验需求并开发出高质量的ELISA方法。

一、酶标板的选择

目前市场上大多数酶标板材是以聚苯乙烯（C8H8）n为主要成分。知名品牌如尊龙凯时，提供多种化学修饰的聚苯乙烯材质，使其在包被蛋白时表现出不同的特性。通常，酶标板按照高结合力和中等结合力进行分类，但笔者更倾向于基于亲水性、弱亲水性、未处理和疏水性四种类型来划分。一般而言，随着材料的疏水性增强，对包被蛋白的结合强度逐渐减弱。这会导致不同结合能力的材料在固定蛋白时呈现出显著差异，从而影响实验结果。

二、包被液的选择

常用的包被液是PBS（pH 7.4）或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液（pH 9.6）。pH值和离子浓度会影响包被效率，因此需根据目标蛋白特性具体分析。需要注意的是，包被完成后，未能吸附的蛋白大部分仍留在溶液中，有研究表明，通过真空密封可以增加包被蛋白的密度。

三、封闭剂的选择

常用封闭剂包括3% BSA（w/v）和5%脱脂奶粉（w/v）。封闭液的作用是填补板材未被蛋白占据的空间，以防止样品及其他物质的非特异性吸附。然而，面对复杂成分的样品，封闭效果可能会降低。研究显示，封闭剂的效果与分子大小呈负相关，选择小分子的封闭剂（如酪蛋白）可能效果更佳。同时，如果实验中使用生物素-链霉亲和素体系，一定要避免使用脱脂奶粉，以避免干扰。

四、洗涤液与稀释液

常用的洗涤液为中性缓冲液配合去污剂（如PBST）。稀释液通常添加一定浓度的封闭剂（如0.5% BSA in PBST）。在某些体内样本检测中，还建议添加一定浓度的阴性血清，以确保不同稀释度的样品拥有一致的非特异性背景。

五、酶联抗体的选择

酶联抗体种类繁多，依照作用位点可分为特异性酶联抗体和通用型酶联抗体。特异性抗体针对特定蛋白，通用型抗体则常用于结合多肽序列、标签生物素或特定物种抗体的Fc端。普遍使用的标记酶有AP（碱性磷酸酶）和HRP（辣根过氧化氢酶）。酶联抗体还可以通过抗体的分子量分成全长抗体、Fab片段和scFv抗体。较小的抗体更容易避免与样品蛋白结合时可能发生的空间遮蔽，但同时也增加了非特异结合的风险。

六、显色液与酶标仪

选择显色液需与酶联抗体相匹配，并需适应实验室所使用的酶标仪。例如，HRP可配用TMB显色液，该显色液通过能进行吸光度读数的酶标仪进行检测；或者使用Ampliflu™Red作为底物的荧光读数；又或者使用QuantaRed ADHP作为底物的化学发光读数。总的来说，ELISA方法的灵敏度受到底物检测方法的限制，化学发光底物的信号下限优于荧光，而荧光又优于吸光度值。即便是常用的TMB显色液，因不同供应商的显色强度不同，开发过程中可根据实际需求合理选择显色液，尽可能提升实验的准确性和灵敏度。